1. 海腎熒光素酶

螢火蟲(chóng)熒光素酶在氧氣,、ATP和鎂離子同時(shí)存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生黃綠色光,，波長(zhǎng)540-600nm。

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱(chēng),。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,，在熒光素氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光,。然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光,。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏,、高效地檢測(cè)基因的表達(dá),，是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

目前，最有代表性的是從甲蟲(chóng)中分離得到的螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）,。

2. 海腎熒光素酶基因

1 熒光酶是一種酶,，能夠?qū)⒒瘜W(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,。2 熒光酶的原理是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的技術(shù),，它可以將一種化學(xué)物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)化為另一種化學(xué)物質(zhì)的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)生物分子和細(xì)胞成像的目的,。3 熒光酶廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域,，例如基因工程、蛋白質(zhì)表達(dá),、細(xì)胞成像等,，是生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的重要工具。

3. 海腎熒光素酶質(zhì)粒

啟動(dòng)子的預(yù)測(cè) 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè) 報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),。

設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段,，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。篩選陽(yáng)性克隆,，測(cè)序,。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,，提純備用,。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，提純備用,。培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞）,，并接種于24孔板中，生長(zhǎng)10-24小時(shí)（80%匯合度）,。將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。加入底物,，測(cè)定熒光素酶的活性,。計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較,。

4. 海腎熒光素酶報(bào)告基因

基因熒光檢測(cè)是一種自然發(fā)光反應(yīng),，通過(guò)熒光素酶與 ATP進(jìn)行反應(yīng)，可檢測(cè)人體細(xì)胞,、細(xì)菌,、霉菌、食物殘?jiān)?，?5秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果。

熒光檢測(cè)的主要缺點(diǎn)在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光,，但含有可衍生的官能團(tuán)用于合成能發(fā)熒光的衍生物,。

5. 海腎熒光素酶載體

pGRE-luc(報(bào)告基因質(zhì)粒)是用于檢測(cè)糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件(glucocorticoid response element, GRE)轉(zhuǎn)錄激

活水平的報(bào)告基因質(zhì)粒。pGRE-luc是以pGL6質(zhì)粒為模板,，在其多克隆位點(diǎn)插入了多個(gè)GRE位點(diǎn),，可以高靈敏度

地檢測(cè)GRE的激活水平，檢測(cè)糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的信號(hào)途徑(glucocorticoid-mediated signaling pathway)的激活水平,。

? pGL6質(zhì)粒是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase)報(bào)告基因檢測(cè)的新一代質(zhì)粒,。該報(bào)告基因質(zhì)粒比

Promega公司的pGL3系列有了全面的改進(jìn)，一方面對(duì)于luciferase的編碼進(jìn)行了改進(jìn),，確保能更好地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行

表達(dá),，同時(shí)對(duì)整個(gè)質(zhì)粒中所有可以被預(yù)測(cè)出的可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)全部進(jìn)行了適當(dāng)?shù)耐蛔兲幚恚诒３衷泄δ懿?/p>

變的情況下,，使各種轉(zhuǎn)錄因子在質(zhì)粒上的非特異性結(jié)合降到最低