1. 層析硅膠活化

1.吸附劑的處理及柱子裝填

　　將一定量薄層層析硅膠裝人搪瓷盤置于烘箱中,，于105C活化2H后，取出放置室溫即可裝柱,。柱子采用干法填充,，填滿整個(gè)柱體，不留死體積,，密封后用柱塞式計(jì)量溶劑泵按丙酮一石油醚(5:95)比例泵人溶劑,，至溶劑流出止。

　　2.上樣

　　將冬凌草的乙醇提取物400G用適量丙酮溶解,，泵人中壓柱柱頭,，然后泵人石油醚1000RID。

　　3.洗脫

　　以一定比例的石油醚一丙酮為洗脫液,，60ML/MIN的流速進(jìn)行梯度洗脫,，柱的使用壓力為2~ 3KG/C 。按每份500ML收集,，TLC檢識(shí)展開(kāi)劑丙酮一(2:8),，顯色劑5%香草醛濃硫酸乙醇液

　　至洗脫完全，相同流份合并,，回收溶劑,。將冬凌草甲素流份合并蒸干。加人適量甲醇熱溶后自然放置,，析出結(jié)晶,，為冬凌草甲素,。

　　4.層析柱再生、平衡

　　有效成分經(jīng)TLC檢識(shí)全部流出后,，用純丙酮5000ML再生,，丙酮一石油醚(5:95)平衡后，可再次上樣,，反復(fù)使用(使用次數(shù)隨原料不同而異,，一般可連續(xù)使用2-6個(gè)月以上)。

　　5.重結(jié)晶

　　冬凌草甲素結(jié)晶析出完全后,，減壓過(guò)濾,，然后用少量甲醇洗滌(洗滌液保留，作下次熱溶冬凌草甲素用),。將冬凌草甲素再用適量甲醇熱溶后放置，結(jié)晶再次析出,，待結(jié)晶完全后,，抽濾，用少量洗滌,，將結(jié)晶室溫下晾干后置真空干燥箱中,，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中,，置干燥器中保存,。

　　6.薄層層析分析

　　取適量冬凌草甲素對(duì)照品及由上述方法得到的冬凌草甲素樣品甲醇溶解后點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以一丙酮(8:2)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi),，5% 香草醛濃硫酸乙醇液顯色,，于105。C烘至斑點(diǎn)清晰,。表明在該展開(kāi)系統(tǒng)下,，冬凌草甲素樣品和對(duì)照品都具有相同的RF值，并呈現(xiàn)出同樣的藍(lán)綠色斑點(diǎn),，在制備的冬凌草甲素樣品中,，沒(méi)有雜質(zhì)斑痕。

2. 硅膠層析法應(yīng)用

硅膠層析法的分離原理是：根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離,， 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過(guò)程即是吸附,、解吸,、再吸附、再解吸過(guò)程,。也就是說(shuō),，利用吸附的特性起分子篩的作用,。

3. 硅膠層析原理

1、干法裝柱嗎,？硅膠被洗脫劑浸透后會(huì)出現(xiàn)透明的現(xiàn)象,。

2、硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離,，a與b的吸附力相差較大時(shí),，a會(huì)替代b被硅膠吸附，但不會(huì)是100％被替代,。3,、一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附,。4,、整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸,、再吸附,、再解吸過(guò)程。5,、若可以使用其它試劑,，最好不用苯，苯的毒性相對(duì)較大,。

4. 層析硅膠的制作過(guò)程

一,，原理

柱層析操作時(shí)，先在圓柱管中填充不溶性基質(zhì),，形成一個(gè)固定相,。將樣品加到柱子上，用特殊溶劑洗脫,，溶劑組成流動(dòng)相,。在樣品從柱子上洗脫下來(lái)的過(guò)程中，根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同,，經(jīng)多次反復(fù)分配將組分分離,。

柱層析法

二，使用方法

從天然產(chǎn)物中提取,、分離和表征生物小分子,，是新藥研發(fā)中獲得先導(dǎo)化合物的主要途徑之一。層析法（Chromatography）是天然產(chǎn)物分離較為常用的方法之一,。 層析法較早是根據(jù)化合物顏色分離一些植物色素,，如今，層析法已經(jīng)演變成為一種高度敏感的,、有效的化合物分離和鑒定方法,。柱層析一般包括常壓柱層析,、中壓柱層析和高壓柱層析。按照柱填料又可分為柱層析硅膠,、離子交換層析,、凝膠滲透色譜、疏水作用色譜等,，其中以柱層析硅膠（正/反相）使用較為為廣泛,。與其他層析方法相比，柱層析具有操作簡(jiǎn)單,，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠 ,，樣品承載量大等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物分離純化的方法之一,。

5. 層析硅膠再生與活化

不能恢復(fù)其吸附活性,。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）?！　游鲇霉枘z為一多孔性物質(zhì),，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)在顆粒表面又有很多硅醇基,。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過(guò)氫鍵的形成而吸附水分,，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低,。若吸水量超過(guò)17%，吸附力極弱不能用作為吸附劑,，但可作為分配層析中的支持劑,。